La PCR est une technique de laboratoire devenue très populaire pendant la pandémie de COVID-19. Le grand principe, développé dans les années 1980, vient de l’amplification d’un échantillon pour le rendre quantifiable.
La première approche inventant le terme PCR digitale (dPCR) a été développée en 1991, et divers instruments ont commencé à arriver sur lle marché vers 2010. Chez Oncodesign Services, nous avons mis en œuvre la technique basée sur la chambre (QIAcuity Four Digital PCR System de Qiagen) afin de mieux répondre aux demandes de nos clients dans plusieurs environnements : découverte (R&D) et réglementaire (BPL et GcLP).
Qu’est-ce que la PCR?
Cela signifie en anglais ‘Polymerase Chain Reaction’. Cette réaction enzymatique permet l’amplification spécifique d’une séquence d’acide nucléique (ADN ou ARN) peu abondante et donc ni détectable ni quantifiable sans cette amplification.
Il s’agit d’un outil très puissant en biologie moléculaire et a de nombreuses applications, notamment dans la recherche génétique, le diagnostic médical et l’analyse médico-légale.
Nous examinons ici pourquoi vous devriez passer à la dPCR plutôt qu’à la PCR quantitative traditionnelle (qPCR).
1. Précision et exactitude accrues
Le dPCR divise un échantillon en plusieurs réactions plus petites, ce qui réduit la variabilité entre les échantillons et augmente la précision et l’exactitude de la mesure. Cela facilite la détection de mutations rares ou de changements subtils dans les niveaux d’expression des gènes.
2. Réduction de l’effet matrice
Grâce à la séparation des échantillons, les inhibiteurs de PCR sont dilués dans chaque partition, ce qui atténue considérablement l’effet de matrice. Comparaison de quantification d’ARN (molécule cible) par dPCR et qPCR en fonction de la quantité d’ARN total endogène chargée par puits PCR.
3. Une sensibilité plus élevée
La dPCR est capable de détecter de plus petites quantités de molécules cibles dans un échantillon par rapport à la qPCR traditionnelle, ce qui la rend utile pour les applications où de très faibles quantités d’ADN ou d’ARN doivent être détectées.
4. Dépendance réduite aux courbes standard
La qPCR traditionnelle nécessite une courbe standard pour calibrer les mesures, ce qui peut introduire des erreurs et de la variabilité. Le dPCR compte le nombre de réactions positives, permettant une quantification absolue sans avoir besoin d’une courbe standard.
5. Robustesse
En utilisant un nombre élevé de petites partitions de très petits volumes, le dPCR est moins sensible aux effets des inhibiteurs et aux variations de préparation des échantillons, ce qui le rend plus robuste et fiable pour les mesures quantitatives.
De nombreuses applications de la dPCR…
Les principales applications impliquent généralement le développement et la validation de méthodes pour soutenir les études de biodistribution/excrétion dans le contexte de programmes permettant l’IND. Ainsi, Oncodesign Services propose le développement, la qualification et/ou la validation conforme aux BPL de méthodes dPCR pour la quantification de produits de thérapie génique dans de nombreux tissus/fluides de différentes espèces.
Une autre application en oncologie concerne l’analyse de la méthylation de l’ADN. La méthylation de l’ADN est une modification épigénétique qui consiste en une modification sur la cytosine des dinucléotides CpG (îlots CpG). De manière générale, lorsque le promoteur d’un gène est méthylé, l’expression du gène en aval est réprimée. Cette modification peut donc influencer l’expression des gènes et constitue un point d’intérêt en oncologie. L’identification de gènes hyperméthylés spécifiques constitue en effet un biomarqueur dans différents types de cancers.
Oncodesign Services développe également la détection de bactéries et de virus par dPCR (depuis la conception d’amorces/sondes jusqu’aux analyses d’échantillons) dans différents types de matrices.
Enfin et surtout, la dPCR, reconnue comme l’une des approches les plus adaptées à la détection d’événements rares, facilitera l’utilisation de fragments d’ADN tumoral circulant (ADNtc) comme biomarqueurs prédictifs potentiels dans la pratique clinique.
A propos de l’auteur:
L’article a été rédigé par Dr Sophie Champlot. Dans son rôle chez Oncodesign Services, Sophie est directrice d’études GLP-GcLP au sein du département DMPK-Sciences bioanalytiques, et spécialisée en biologie moléculaire/qPCR/dPCR pour répondre aux besoins des clients.
Réference:
1 Vogelstein and Kinzler, 1999 – DOI: 10.1073/pnas.96.16.9236
Mots clés associés:
dPCR / qPCR / bioanalysis /